除了熒光的光譜位置外，熒光量子產(chǎn)率（η fl；英文fluorescence quantum y field，QY）是熒光團(tuán)的一個(gè)重要光學(xué)參數(shù)。除了消光系數(shù)的大小，當(dāng)染料用作熒光標(biāo)記時(shí)，量子產(chǎn)率的水平特別決定了獲得的信號(hào)強(qiáng)度：因此在英語(yǔ)用法中，消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的乘積被稱為作為熒光團(tuán)的“亮度"。

量子產(chǎn)率本質(zhì)上取決于染料的分子結(jié)構(gòu)，但也受到許多外部因素的影響。這些包括環(huán)境的溫度、粘度、極性和pH值。這種環(huán)境可以由溶劑分子和任何溶劑組成，也可以由例如偶聯(lián)的生物分子或細(xì)胞膜組成，熒光染料位于其附近。通過(guò)改變熒光，可以得出有關(guān)環(huán)境某些特性的結(jié)論：可以說(shuō)，熒光染料充當(dāng)分子探針。

熒光量子產(chǎn)率定義為以熒光形式發(fā)射的光子數(shù)（= 光量子）與樣品先前吸收的光子數(shù)之比：如果所有



吸收的光子都以熒光形式發(fā)射，則量子產(chǎn)率為 1 或 100 % 獲得。然而，激發(fā)態(tài)的非輻射失活過(guò)程總是與發(fā)射競(jìng)爭(zhēng)，因此部分吸收的能量以熱量的形式釋放到環(huán)境中。

正是這種現(xiàn)象被用于絕對(duì)判定通過(guò)“量熱"方法（例如熱開(kāi)花方法）的量子產(chǎn)率。這需要相對(duì)復(fù)雜的測(cè)試設(shè)置以及對(duì)測(cè)量概念和評(píng)估的全面理論理解。

更簡(jiǎn)單地說(shuō)，熒光團(tuán)（樣品）的未知量子產(chǎn)率可以通過(guò)將其與熒光光譜儀中標(biāo)準(zhǔn)或參考染料（參考）的已知量子產(chǎn)率進(jìn)行比較來(lái)確定。這種所謂的相對(duì)確定可以通過(guò)不同的方式進(jìn)行：

• 在單次測(cè)量中比較樣品與參考染料

• 在幾個(gè)單獨(dú)的測(cè)量中將樣品與幾種參考染料進(jìn)行比較

• 將樣品與不同濃度的參考染料進(jìn)行比較，并對(duì)獲得的測(cè)量值進(jìn)行后續(xù)評(píng)估。

結(jié)果的統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確性隨著進(jìn)行的比較測(cè)量的次數(shù)而增加。

使用相對(duì)方法的理論先決條件是要比較的兩種溶液，樣品和參考，在激發(fā)波長(zhǎng)下具有相同的吸收，因此吸收相同數(shù)量的光子。然后兩種溶液在相同條件下記錄的積分熒光光譜的商（IF = 熒光帶的面積）給出兩種染料的量子產(chǎn)率比，這樣就可以很容易地計(jì)算出未知的量子產(chǎn)率：



記錄樣品和參考的整個(gè)熒光光譜（積分熒光強(qiáng)度）的重要性通過(guò)以下示例用這種比較方法進(jìn)行了說(shuō)明：染料



ATTO 488羧基和ATTO 430LS羧基在吸收光譜的交叉點(diǎn)被激發(fā)（相同的吸收) 和測(cè)量的熒光光譜。與標(biāo)準(zhǔn)品（羅丹明 6G）的比較測(cè)量導(dǎo)致ATTO 488羧基的熒光量子產(chǎn)率為 80%。使用此值，使用描述的相關(guān)方法獲得ATTO 430LS的 65% 的值羧基。另一方面，如果您只查看相應(yīng)熒光最大值處的強(qiáng)度，您只能從ATTO 488羧基的已知 80% 中獲得 33% 的ATTO 430LS羧基。這種強(qiáng)烈的差異是由于熒光帶的寬度不同，即兩種染料的熒光光譜分布不同。 通過(guò)使用相同的測(cè)量參數(shù)，可以從設(shè)備端實(shí)現(xiàn)用于記錄樣品和參考熒光光譜的相同條件。這些包括光束路徑的幾何形狀（例如 90° 或正面布置）、檢測(cè)器放大（增益）、狹縫寬度（或帶通）和相同的激發(fā)波長(zhǎng)。


例如，可以選擇樣品和參比的長(zhǎng)波吸收帶的交點(diǎn)作為激發(fā)波長(zhǎng)。然后，在染料條帶的相應(yīng)最大值處的吸收可能略有不同。
使用示例 阿托 488 羧基和 阿托 532 羧基在各自的吸收最大值處的吸光度值略有不同，這一點(diǎn)變得很清楚：在記錄了兩種測(cè)量溶液的吸收光譜后，可以通過(guò)疊加兩種光譜來(lái)確定兩種溶液具有相同吸光度（此處為0.0183）的交點(diǎn)（此處為513.1 nm）。（對(duì)于較小的值，吸光度和吸光度相同。



另一方面，如果決定在樣品和參考的吸收最大值處激發(fā)，則兩種溶液在各自波長(zhǎng)下必須具有相同的吸收。在所示示例中，ATTO 488羧基可在 500 nm 激發(fā)，ATTO 532羧基可在 532 nm 激發(fā)；兩種溶液的吸光度均為 0.0420。



在這種情況下，必須在熒光測(cè)量中對(duì)兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)下的不同激發(fā)強(qiáng)度進(jìn)行相應(yīng)的校正。在現(xiàn)代熒光光譜儀中，這種與波長(zhǎng)相關(guān)的強(qiáng)度差異由光電二極管確定為標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)還測(cè)量激發(fā)光源隨時(shí)間的強(qiáng)度波動(dòng)。此校正必須在測(cè)量期間通過(guò)設(shè)備軟件激活，因?yàn)榇撕髮o(wú)法再進(jìn)行。

此外，所選測(cè)量范圍應(yīng)覆蓋整個(gè)熒光光譜，即長(zhǎng)波邊緣的測(cè)量強(qiáng)度應(yīng)幾乎降至檢測(cè)器噪聲水平。

即使?jié)M足所有這些要求，熒光量子產(chǎn)率的精確測(cè)定在實(shí)踐中也非常苛刻，需要做好充分的準(zhǔn)備和仔細(xì)的測(cè)量。

 
關(guān)于量子產(chǎn)率測(cè)量和可能的誤差來(lái)源的說(shuō)明
 

• 參比染料必須合適，并且必須足夠精確地知道其量子產(chǎn)率。例如，可以通過(guò)將其與另一個(gè)參考進(jìn)行比較來(lái)確保這一點(diǎn)。

• 參比染料的選擇方式應(yīng)使其能夠在與樣品相同的范圍內(nèi)被吸收，即激發(fā)。理想情況下，兩個(gè)吸收光譜重疊，并且可以在熒光測(cè)量期間在兩個(gè)波段的交叉點(diǎn)激發(fā)。

• 必須保持所有玻璃器皿和比色皿絕對(duì)清潔。

• 使用的溶劑應(yīng)具有“光譜學(xué)"規(guī)格，并應(yīng)檢查其固有熒光。

• 例如，如果由于溶解度的差異而將不同的溶劑用于樣品和參比，則必須通過(guò)在計(jì)算中包括兩個(gè)折射率n來(lái)考慮這一點(diǎn)：

• 對(duì)于熒光測(cè)量，應(yīng)使用光程長(zhǎng)度為 10 mm 的標(biāo)準(zhǔn)熒光比色皿。

• 為了減少重吸收效應(yīng)的發(fā)生，10mm電池中的吸光度不應(yīng)超過(guò)0.05。
  在較高濃度下，可能會(huì)發(fā)生所謂的內(nèi)部濾光片效應(yīng)，這極大地偽造了熒光測(cè)量：
  一方面，激發(fā)光不再深入溶液，這可能導(dǎo)致比色皿中心的樣品激發(fā)減少。
  另一方面，從那里發(fā)出的熒光在離開(kāi)比色皿之前通過(guò)溶液時(shí)被光束路徑中的其他熒光團(tuán)部分（重新）吸收。這導(dǎo)致熒光光譜在短波范圍內(nèi)被切斷。

• 必須注意確保吸收測(cè)量的基線不會(huì)因未溶解顆粒或臟比色皿窗口的光散射而失真。

• 順便說(shuō)一下，這種散射現(xiàn)象也會(huì)干擾熒光測(cè)量，因?yàn)樯⑸涔饪梢缘竭_(dá)溶液中顆粒或比色皿表面上的檢測(cè)器。因此，在測(cè)量前應(yīng)μ過(guò)濾所使用的溶劑和溶液，并用不起毛的布從外部擦拭比色皿窗口。注意：指紋！

• 熒光測(cè)量的測(cè)量參數(shù)（增益、狹縫寬度）必須適應(yīng)發(fā)生的熒光強(qiáng)度，以便所使用的檢測(cè)器（例如光電倍增管）不會(huì)因過(guò)多的光而損壞。測(cè)量必須在探測(cè)器的線性范圍內(nèi)進(jìn)行，因?yàn)橹挥羞@樣，測(cè)量的光強(qiáng)度才會(huì)與照射的光強(qiáng)度成正比。

• 人們應(yīng)該意識(shí)到溫度對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。

 
許多制造商現(xiàn)在都包含使用其熒光光譜儀測(cè)量熒光量子產(chǎn)率的精確說(shuō)明和工作說(shuō)明，也可以從相應(yīng)網(wǎng)站下載。通常也可以在這里找到有關(guān)相應(yīng)設(shè)備設(shè)置和測(cè)量參數(shù)的詳細(xì)信息和注意事項(xiàng)。正在努力開(kāi)發(fā)熒光標(biāo)準(zhǔn)的方法和程序。我們給出的熒光光譜是用HORIBA Jobin Yvon的

Fluorolog 3熒光光譜儀測(cè)得的。為此，ATTO-染料在 22°C 下檢查水溶液（PBS，pH 7.4）中的相應(yīng)羧基衍生物。測(cè)量是在標(biāo)準(zhǔn)的 90° 排列中進(jìn)行的，具有水平的激發(fā)和發(fā)射極化。為了確定ATTO染料的熒光量子產(chǎn)率，將具有熒光量子產(chǎn)率的熒光團(tuán)用作參考染料。取決于光譜范圍，例如B、使用羅丹明6G、羅丹明630等。

熒光光譜的一般信息

在吸收光譜儀的情況下，幾乎只使用雙光束裝置，其中樣品溶液和參比物質(zhì)（例如帶有純?nèi)軇┑谋壬螅巴瑫r(shí)"掃描。結(jié)果，獲得的頻譜成為所謂的 設(shè)備特性 這是由于單色器（光柵、狹縫）和鏡子反射的不同透射率，除其他外，對(duì)于不同的偏振光和特定的檢測(cè)器特性。

由于熒光光譜中原則上不存在這種參考光束路徑，因此必須以不同的方式校正每個(gè)熒光光譜儀的器件特性，具體取決于光學(xué)元件和光束路徑的路徑，這些特性是不同的，以獲得樣品的“真實(shí)"熒光光譜。

在現(xiàn)代熒光光譜儀的情況下，控制和評(píng)估軟件通常包含所謂的 校正功能，可用于在測(cè)量過(guò)程中直接或通過(guò)用戶的后續(xù)指令校正被測(cè)設(shè)備光譜。此校正功能由制造商創(chuàng)建，例如，通過(guò)將相關(guān)設(shè)備測(cè)量的發(fā)射光譜與校準(zhǔn)燈的實(shí)際發(fā)射光譜進(jìn)行比較。

除此之外，在每次熒光測(cè)量中都應(yīng)考慮另一種現(xiàn)象。這些是 熒光偏振： 只有當(dāng)熒光團(tuán)在激發(fā)態(tài)的生命周期內(nèi)能在培養(yǎng)基中自由移動(dòng)時(shí)，才能獲得非偏振熒光。在這種情況下，水平和垂直偏振熒光的比例是相同的。

自由遷移率受溶劑的溫度相關(guān)粘度和分子體積的影響。

在丙酮、甲醇、乙醇和水等低粘度溶劑中，這種極化效應(yīng)通常只在室溫測(cè)量中壽命在納秒范圍內(nèi)的小型有機(jī)熒光團(tuán)中起次要作用。

但是，如果樣品和/或參比的熒光由于分子尺寸和/或熒光壽命的強(qiáng)烈不同而不再非偏振甚至不同的偏振，則可能導(dǎo)致測(cè)量的熒光光譜偽造，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤計(jì)算的量子產(chǎn)率。

為了確定熒光基團(tuán)溶液的熒光偏振，有一種相對(duì)簡(jiǎn)單的方法，可以在J. R. Lakowicz中找到其理論推導(dǎo)和解釋。

研究與大分子（聚合物、蛋白質(zhì)、DNA等）偶聯(lián)的熒光標(biāo)記物的熒光偏振，其自由遷移率在其激發(fā)態(tài)的生命周期內(nèi)受到限制甚至受到抑制，可以與FRET技術(shù)相結(jié)合，為分子結(jié)構(gòu)（幾何形狀，距離，方向）和相關(guān)動(dòng)態(tài)現(xiàn)象提供重要的見(jiàn)解。